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匹妥布替尼可选择性地强效抑制BTK野生型和C481突变型激酶活性。在激酶测定中，匹妥布替尼对BTK的酶选择性比对370种非BTK野生型激酶（98%）的选择性高出300多倍。

匹妥布替尼的效力

Brandhuber 等人 2018 年的一项研究初步证实匹妥布替尼对野生型布鲁顿氏酪氨酸激酶 （BTK） 和 C481 突变 （BTK C481S） 激酶的效力和活性。¹

激酶活性测定

在激酶活性测定中，匹妥布替尼是野生型 BTK 和 BTK C481S 的有效且选择性的非共价抑制剂。^1,2

在纯化的酶激酶测定中，使用 1 μM 匹妥布替尼和相当于每种酶的 K_M 的三磷酸腺苷 （ATP） 浓度分析了 371 种野生型激酶。匹妥布替尼有效且选择性地抑制 BTK 和 BTK C481S，并且与测试的 370 种非 BTK 野生型激酶中的 98% 相比，对 BTK 的酶选择性高出 300 倍以上。 表 1总结了前 5 种激酶的激酶测定结果，这些激酶被 1 μM匹妥布替尼抑制了 50% 以上。¹ 

表 1. 纯化酶激酶分析结果^1,3 

缩略词: ATP = 三磷酸腺苷; BRK = 酪氨酸蛋白激酶6; BTK = 布鲁顿氏酪氨酸激酶 (野生型); BTK C481S = C481突变的BTK; ERBB4 = 受体酪氨酸蛋白激酶erbB-4; MEK2 = 双特异性丝裂原活化蛋白激酶激酶2; ND = 未定义; POC =控制百分比。

细胞结合测定

在人外周单核细胞 （PBMC） 中，匹妥布替尼有效且选择性地结合 BTK。¹

在一项化学蛋白质组学研究中，通过比较来自匹妥布替尼处理的PBMC与未处理的PBMC的探针标记肽（ATP和二磷酸腺苷[ADP]的生物素酰基磷酸盐）信号，确定了匹妥布替尼与人PBMC中180种激酶的结合。两种激酶竞争性抑制核苷酸类似物的结合，最大抑制浓度 （IC₅₀） 值的一半 <5 μM，其中BTK的平均IC₅₀ 值确定为10.3 nM （表 2）。¹

表 2. 从人类单核细胞中鉴定的激酶，IC50 <5 μM¹

缩略词: BTK = 布鲁顿氏酪氨酸激酶; IC₅₀ = 半数最大抑制浓度; TEC = 酪氨酸蛋白激酶。

细胞中的信号传导活性

在细胞测定中，匹妥布替尼以个位数纳摩尔效力抑制 BTK 依赖性细胞读数，如图所示 图 1。¹

图 1. 匹妥布替尼对HEK293细胞中BTK自身磷酸化的影响¹

图释: 稳定表达布鲁顿酪氨酸激酶 (BTK) 野生型或 C481 突变体 (BTK C481S) 激酶的 HEK293 细胞系用匹妥布替尼或伊布替尼处理 2 小时，并通过免疫印迹分析 BTK 在酪氨酸 223 处的自身磷酸化。 将BTK的磷酸化水平标准化为总BTK水平。使用GraphPad Prism 7.04软件中的4参数拟合计算IC₅₀值。匹妥布替尼在表达野生型BTK的细胞中的IC₅₀值为8.6±0.3nM，在表达BTK C481S突变体的细胞中的IC₅₀值为8.8±1.8nM。

缩略词: BTK = 布鲁顿氏酪氨酸激酶; C481S =C481突变型BTK; Y 223 = 酪氨酸223。

匹妥布替尼的临床前表征

Gomez 等人 2023 年的一项研究概述了匹妥布替尼对野生型 BTK 和 BTK C481 突变体的结合和活性的详细临床前表征。³

激酶抑制

在放射性体外酶测定中，匹妥布替尼对BTK和BTK C481S具有有效抑制作用，IC₅₀ 值分别为3.2和1.4 nM（图 2）。³

图 2. 匹妥布替尼对BTK和BTK C481S突变体活性的影响³

图释: 剂量反应曲线显示匹妥布替尼抑制 BTK 和 BTK C481S 激酶活性。

缩略词: BTK = 布鲁顿氏酪氨酸激酶。

注: 这项研究最初发表在《Blood Online》上 。Gomez EB, Ebata K, Randeria HS, et al. Pirtobrutinib preclinical characterization: a highly selective, non-covalent (reversible) BTK inhibitor. Blood. Prepublished February 16, 2023; DOI 10.1182/blood.2022018674 IF: 23.1 Q1 B1.

结合表征

在表面等离子体共振结合研究中，匹妥布替尼被证明是 BTK 和 BTK C481S 的可逆抑制剂，具有

• 个位数纳摩尔范围内的结合亲和力
• 低解离率，以及
• BTK-和BTK C481S-匹妥布替尼复合物半衰期为1.5至2.4小时（表 3）。³  

表 3. 匹妥布替尼与 BTK 和 BTK C481 替代突变体的结合动力学³

缩略词: BTK =布鲁顿氏酪氨酸激酶; K_D = 解离平衡常数 (k_off /k_on); k_off = 解离速率常数 (s^-1); k_on = 结合速率常数 (M^-1s^-1); t_1/2 = 结合半衰期 (ln 2/k_off).

基于细胞的检测

在使用稳定表达BTK或BTK C481S的HEK293细胞的细胞磷酸化测定中，匹妥布替尼抑制BTK Y223的自磷酸化，IC₅₀ 值分别为8.8和9.8 nM。³

在 B 淋巴细胞系 Ramos RA1 和套细胞淋巴瘤 （MCL） 细胞系 REC-1 中，匹妥布替尼有效抑制

• BTK Y223 自身磷酸化和
• Y551 的磷酸化，BTK 上游激酶位点的靶点。³

抑制细胞增殖

匹妥布替尼抑制活化 B 细胞弥漫性大 B 细胞淋巴瘤细胞系 TMD8 和 MCL 细胞系 REC-1 中的细胞增殖，IC₅₀ 值分别为 6.4 和 3.1 nM。在表达BTK C481S的TMD8中保持抗增殖效力，IC₅₀ 值为26.4 nM。³

B 细胞活化

匹妥布替尼剂量依赖性降低 TMD8 和 REC-1 的抗 IgM 刺激钙通量，IC₅₀ 值分别为 6.3 和 8.6 nM。³

在来自健康供体的 PBMC 中，匹妥布替尼被证明可以以剂量依赖性方式降低抗 IgM 诱导的 CD69 在 CD19+ B 细胞上的表达，IC₅₀ 值为 4.7±1.7 nM。³

体内疗效评估

使用 2 个活化的 B 细胞弥漫性大 B 细胞淋巴瘤细胞系 OCI-Ly10 和 TMD8 以及 MCL 细胞系 REC-1 在小鼠异种移植模型中评估了 匹妥布替尼的体内疗效。匹妥布替尼在所有 3 种异种移植肿瘤模型中均表现出显着的剂量依赖性肿瘤生长抑制 （表 4），并且在小鼠中耐受性良好。³ 

肿瘤消退分析显示，30 mg/kg 每日两次 （BID） 处理的 TMD8 异种移植模型的肿瘤大小消退 -49%，在 50 mg/kg BID 处理的 REC-1 异种移植模型  中消退 -11%。  

在表达 BTK C481S 突变体的 TMD8 异种移植模型中也观察到显着的剂量依赖性肿瘤生长抑制和肿瘤消退。³

表 4. 匹妥布替尼在BTK表达淋巴瘤异种移植模型中的体内疗效³

缩略词: BID =每天两次。

^a 与第 28 天使用载体治疗相比。

^b 与第 14 天使用载体治疗相比。

^c 与第 21 天使用载体治疗相比。

上次审阅日期：2023年2月15日

参考文献

1. Brandhuber B, Gomez E, Smith S, et al. LOXO-305, a next generation non-covalent BTK inhibitor, for overcoming acquired resistance to covalent BTK inhibitors. Poster presented at: 6th Annual Meeting of the Society of Hematologic Oncology; September 12-15, 2018; Houston, TX.

2. Jaypirca [package insert]. Indianapolis, IN: Eli Lilly and Company; 2024.

3. Gomez EB, Ebata K, Randeria HS, et al. Pirtobrutinib preclinical characterization: a highly selective, non-covalent (reversible) BTK inhibitor. Blood. Published online February 16, 2023. https://doi.org/10.1182/blood.2022018674